细菌截留验证要做哪些准备?
上一篇介绍了细菌截留验证的挑战微生物选择(复习请戳:细菌截留验证一定要用缺陷短波单胞菌吗?),以缺陷短波单胞菌ATCC® 19146™为例,通常可以冻干的形式从美国典型培养物中心(American Type Culture Collection,ATCC®)获得。在按照ATCC®规程复苏微生物后,可以按照微生物操作规范在适宜的培养基中冷藏或冷冻保存。需要建立用于挑战研究的工艺分离物的储存条件。
两种标准技术被公认适宜用于细菌挑战试验用缺陷短波单胞菌的制备和维护:乳糖肉汤(saline lactose broth,SLB)法和冷冻细胞浆(FCP)法。两种方法都可有效生产适宜的缺陷短波单胞菌悬液,其尺寸大约为直径0.3~0.4μm,长度0.6~1.0μm。
替代的培养基和培养方法也可能同样有效,只要这些方法可以生产出单一的,分散的细胞,尺寸适宜,可穿过0.45μm孔径的膜过滤器。替代培养法需要被验证。库存的细菌挑战培养物的聚集情况可用光学显微镜检查。如果观察到聚集现象,可考虑将保存培养物置于超声波清洗槽的冷水中10分钟将团聚物分散。水浴的气穴作用可将细菌细胞分散,而不影响细胞活性。应使用光学显微镜、活性计数和0.45μm孔径对照过滤器的下游回收来确认分散效果。
细菌挑战试验浓度应保证在目标工艺时间里的均一性,挑战的水平达到基于过滤器表面积至少107CFU/cm2。当计算细菌挑战浓度时,应综合考虑诸如流速、时间和压差等操作参数。
缺陷短波单胞菌悬液的生存力和滴度应使用合适的回收培养基来确认,例如大豆酪蛋白消化肉汤或者米勒辛顿琼脂。当进行过滤器挑战时,细菌挑战菌悬液的活力滴度应当在挑战前和挑战后立刻被确定。上游细菌滴度应使用被认可的微生物学测试方法确认。应使用同样的培养基确认任何在下游回收的缺陷短波单胞菌。
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